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淋巴成纖維細胞培養(yǎng)方法

瀏覽次數(shù):695發(fā)布日期:2024-11-01

淋巴成纖維細胞培養(yǎng)方法

1、細胞傳代:細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%胰酶(T25瓶),使胰酶覆蓋整個瓶或皿,蓋好放入培養(yǎng)箱消化;

③1-2min后,顯微鏡下觀察細胞,若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化;若細胞還是貼壁,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止;

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清;

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基;

⑥懸浮細胞直接離心收集,細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇:

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,時間1min左右,加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存:待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次,加入1mL 0.25%胰蛋白酶(T25瓶)

②1-2min后,顯微鏡下觀察細胞,大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化;

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1ml凍存液重懸細胞;

④將凍存管放入程序降溫盒,放入-80℃冰箱,4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。
4、細胞計數(shù)與活力評估:在進行細胞傳代、復蘇或凍存前,進行細胞計數(shù)與活力評估是至關重要的步驟。①取少量細胞懸液,與等體積的0.4%臺盼藍溶液混合,靜置2-3分鐘。②使用血細胞計數(shù)板,在顯微鏡下計數(shù)活細胞(未被臺盼藍染色的細胞)與死細胞(被臺盼藍染成藍色的細胞)。③計算細胞總數(shù)及活力百分比(活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。確保細胞活力高于90%方可用于后續(xù)實驗,以保證實驗結果的準確性和可靠性。

5、培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化:淋巴成纖維細胞的培養(yǎng)還需注意培養(yǎng)環(huán)境的細節(jié)優(yōu)化。①維持培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度恒定在37℃,濕度飽和,并通入5% CO?以保持適宜的pH值。②定期更換培養(yǎng)基,一般為每2-3天一次,以去除代謝產(chǎn)物,補充營養(yǎng)物質。③使用經(jīng)過滅菌處理的器材和試劑,減少污染風險。通過這些措施,可以進一步提升細胞的生長狀態(tài),促進實驗的順利進行。


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